* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 4-93 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4-94)

6. ПЕРЕИЗДАНИЕ (март 1999 г.) с Изменениями N 1, 2, утвержденными в октябре 1981 г., январе 1987 г. (ИУС 1-82, 4-87)

Настоящий стандарт распространяется на мясо и субпродукты от всех видов убойного скота и устанавливает методы бактериологического исследования для выявления в них аэробных бактерий (бацилл сибирской язвы, бактерий из рода сальмонелл, бактерий из рода кишечной палочки-Эшерихий, бактерий из рода протея, бактерий рожи свиней, бактерий листериоза, бактерий пастереллеза, бактерий из группы кокков) и анаэробных бактерий (патогенных и токсигенных клостридий).

Бактериологическое исследование мяса и субпродуктов производят во всех случаях, предусмотренных действующей нормативно-технической документацией, правилами ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов и другими нормативными актами, а также по требованию органов, осуществляющих ветеринарный или санитарный надзор.

(Измененная редакция, Изм. N 2).

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ

1.1. В зависимости от характера заболевания на бактериологическое исследование направляют от туши:

- часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8x6x6 см;

- лимфатические узлы - поверхностный шейный или собственно подкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соединительной и жировой тканью, а от свиней - поверхностный шейный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый первого ребра и надколенный;

- долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.

Для бактериологического исследования на листериоз направляют: головной мозг, долю печени и почку.

Для бактериологического исследования на возбудителя сибирской язвы направляют лимфатический узел пораженного органа или лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации подозрительного фокуса, отечную ткань, ухо, а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел.

При исследовании полутуш или четвертин туш берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.

При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной таре, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические узлы сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость и рассол.

Примечание. Если берут часть печени, почки, селезенки, то поверхность разреза прижигают.

1.2. Образцы завертывают каждый в отдельности в полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354 или пергамент по ГОСТ 1341, помещают в бумажный пакет, на котором ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию в общей таре (ящике).

1.3. При необходимости пересылки образцов в лабораторию, расположенную за пределами предприятия или хозяйства, где отбирают образцы, тару с образцами опечатывают или пломбируют.

В сопроводительном документе указывают:

- наименование продукта с указанием вида мяса, от которого взят образец, и его количество;

Обработку и микроскопию производят по п.4.3.4.1.

4.3.7.3. Диагностическая оценка интенсивности свечения сальмонелл

При микроскопии мазков из культуры или мазков-отпечатков из органов и тканей бактерии сальмонелл дают яркое изумрудно-зеленоватое свечение по периферии бактерий с хорошо выраженной центральной темной зоной. Фон препарата темный с оранжево-красным окрашиванием посторонней микрофлоры, тканевых элементов и других органических частиц (при применении альбумина, меченого родамином), содержащихся в исследуемых препаратах.

Характерное свечение контура (ободка) при визуальном осмотре оценивается в крестах:

"+ + + +" - сияющее зеленовато-желтоватое свечение;

"+ + +" - яркое желтовато-зеленоватое свечение;

"+ +" - умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свечение отчетливо заметного контура;

"+" - слабое беловатое свечение различимого контура;

"-" - клетки в виде сероватых теней, контур отсутствует или слабо заметен на отдельных участках периферии клеток (не у всех микробов).

4.3.7.4. Положительным результатом обнаружения сальмонелл считается свечение типичных для сальмонелл форм, оцениваемое не ниже чем на два креста при условии, что в контрольных препаратах, окрашенных рабочим разведением гетерологической сыворотки, оно оценивается отрицательно, а также при отрицательных результатах окрашивания сальмонеллезными флуоресцирующими сыворотками гетерологических бактерий (кишечной палочки, протея).

Свечение на один крест оценивается как сомнительное, и исследование повторяют.

4.3.7.5. Проведение люминесцентно-серологического исследования сальмонелл в культурах, мясе и паренхиматозных органах непрямым способом

Люминесцентно-серологическое исследование состоит из двух этапов.

Первый этап. Обработка мазков из культур, мазков-отпечатков иммунной сывороткой.

После фиксации мазков этиловым спиртом, на мазки из культур или мазки-отпечатки из мяса или органов наносят пастеровской пипеткой одну-две капли поливалентной сальмонеллезной сыворотки, разведенной физиологическим раствором 1:32. Мазки помещают в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой и выдерживают 30 мин при комнатной температуре или 15 мин при температуре 37 °С.

Несвязавшуюся иммунную сыворотку отмывают 5 мин водопроводной водой, мазки высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37 °С.

Второй этап. Окраска мазков из культур, мазков-отпечатков люминесцирующей сывороткой против гамма-глобулина кролика (меченого ФИТЦ) или смесью сыворотки с альбумином, меченым родамином.

При окраске смесью люминесцирующей сыворотки против гамма-глобулина кролика (меченого ФИТЦ) или смесью люминесцирующей сыворотки с альбумином, меченым родамином, готовят рабочую смесь, как указано в п.4.3.7.

Обработку и микроскопию мазков производят по п.4.3.4.1. Диагностическую оценку интенсивности свечения производят по п.4.3.7.3.

4.4. Метод выявления анаэробных бактерий

4.4.1. Сущность метода выявления анаэробных бактерий заключается в определении их способности расти в отсутствии кислорода воздуха, морфологии возбудителей, роста на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.

Удовлетворительные анаэробные условия создаются в жидкой питательной среде, где в качестве восстановителя применяют мясо, печень, которые одновременно служат и источником питания.

Среда должна быть фасована во флаконы или пробирки таким образом, чтобы площадь поверхности среды по абсолютной величине не превышала ее объема, и поверхность ее была изолирована от кислорода воздуха.

Исследование на анаэробные бактерии проводят при подозрении на следующие заболевания: эмфизематозный карбункул (эмкар), злокачественный раневой газовый отек, брадзот овец, дизентерию ягнят, энтеротоксемию овец, столбняк, некробактериоз, ботулизм.

4.4.2. Проведение исследования

Материалом для исследования при эмкаре и злокачественном раневом газовом отеке являются кусочки пораженных мышц, отечные ткани, лимфатические узлы, печень и селезенка; при брадзоте овец - кровь из сердца, слизистая оболочка сычуга и тонкого отдела кишечника, инфильтрат подкожной клетчатки; при дизентерии ягнят и энтеротоксемии овец - содержимое кишечника, пораженная почка; при столбняке - раневой секрет, гной, кусочки тканей, которые берут из глубоких слоев пораженных участков; при некробактериозе - некротические фокусы паренхиматозных органов; при ботулизме - содержимое желудка, толстых кишок, селезенка, кусок печени и головной мозг.

Диагноз на анаэробные инфекции ставят на основании бактериоскопии, посева материала и биопробы на животных.

Для бактериоскопии из материала готовят несколько мазков или мазков-отпечатков, которые окрашивают метиленовой синью или по Граму.

При просмотре мазков обращают внимание на форму, расположение отдельных микробов, наличие и расположение спор, наличие капсул и отношение к окраске по Граму.

Для посева материал обжигают и навеску массой 10 г растирают в стерильной ступке с добавлением двойного количества физиологического раствора.

По 3-5 см приготовленной взвеси засевают в четыре большие пробирки с мясной средой типа Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см, предварительно прогретой в кипящей водяной бане в течение 20-30 мин, а затем быстро охлажденной до температуры не ниже 50 °С. Посевы перед термостатированием прогревают для всех указанных анаэробов две пробирки при температуре 80 °С в течение 20 мин; при исследовании на Cl. botulinum типа одну пробирку при температуре 60 °С в течение 15 мин (при этом сохраняются споры Cl. botulinum типа ), а другую при 80 °С в течение 20 мин. Остальные пробирки оставляют непрогретыми.

При подозрении на Cl. botulinum для выявления типа две пробирки - одну непрогретую и одну прогретую при 60 °С выдерживают при температуре 28 °С. Другие две пробирки (непрогретую и прогретую при 80 °С) инкубируют при температуре 37 °С на другие анаэробные бактерии.

Термостатирование проводят в течение 5-10 суток; наблюдение за ростом производят ежедневно. При обнаружении роста производят микроскопическое исследование.

Морфология и характер роста на среде Китт-Тароцци отдельных патогенных анаэробных бактерий приведены в табл.5.

Таблица 5

Наименование анаэробных бактерий

Морфология

Характер роста на среде Китт-Тароцци

Величина микробов, мкм

Форма палочек

Подвиж-
ность

Споры

длина

ширина

Мазки из материала

Форма и расположение

Возбудитель шумящего карбункула

Cl. Chauvoei

2-8

0,5-1,0

Спорообразующая полиморфная (веретенообразная, шаровидная, грушевидная), толстая с закругленными концами палочка, располагающаяся одиночно и парами

Овальная, центральное или субконцевое

Через 16-20 ч слабое равномерное помутнение, газообразование

Анаэробные бактерии группы злокачественного раневого отека:

Cl. septicum

Cl. oedematiens

8-15

2,5-10

Отдельные палочки с закругленными краями, нередко нити, особенно с поверхности печени

Овальная; центральное или субконцевое; свободно лежащее

Через 16-24 ч равномерное помутнение с газообразованиями, в дальнейшем бульон просветляется и на дне образуется хлопьевидный осадок

Типа и

5-10

0,8-1,0

Крупная полиморфная с закругленными концами палочка

Овальная; центральное или субтерминальное

Нежный рост со слабым газообразованием, через 18-24 ч бульон просветляется, на дне хлопьевидный осадок

Cl. histolyticum

2-5

0,5-0,8

Тонкие палочки с закругленными концами; располагаются одиночно, парами или цепочками

Овальная; центральное или субтерминальное (форма игольного ушка)

Обильное равномерное помутнение с последующим образованием осадка, без газообразования

Cl. perfringens

4-8

1,0-1,5

Толстая палочка со слегка закругленными обрубленными концами. В организме животного образует капсулу

Овальная; центральное или субтерминальное

Через 5-6 ч появляется равномерное помутнение, бурное газообразование, через 48 ч среда просветляется

Cl. sordelii

2-4

1,0-1,5

Полиморфная палочка с закругленными концами, расположены по 2-3 членика, встречаются цепочки и нити

Овальная, располагается к концам

Интенсивное помутнение среды и газообразование, в старых культурах дает осадок, который тянется в виде слизистых нитей

Cl. sporogenes

3-7

0,8-1,1

Палочки с закругленными концами, быстро образуют споры

Овальная; центральное или субтерминальное

Обильный рост с газообразованием и неприятным гнилостным запахом

Возбудитель столбняка

Cl. tetani

3-10

0,4-0,8

Палочки с закругленными концами

Круглая; концевое в виде барабанной палочки

Интенсивная муть, через 48-72 ч наступает просветление среды. Культура издает запах жженого рога

, , , , , (возбудитель ботулизма)

Cl. botulinum

2,6-10

0,3-0,8

Толстая палочка с закругленными концами

Овальная; субтерминальное ("теннисная ракетка"), реже центральное

Помутнение среды, газообразование, культура издает запах прогорклого масла

Возбудитель некробактериоза

Bact. necrophorum

0,5-1,0

Полиморфная, нити различной длины, короткие палочки и даже формы кокков

Палочки и короткие нити обычно одинаковой толщины, зернисто-

окрашенные нити

Не образуют

Интенсивная муть, очень слабое газообразование

Обозначение:

"+" - подвижные;

"-" - неподвижны.

Выделение чистой культуры производится по следующей методике (метод рассева по Вейону-Виньялю).

На мартеновском бульоне готовят полужидкий агар (0,5%) с 0,5% глюкозы и разливают в пробирки по 9 см; агар подогревают до температуры 55 °С и производят посев в убывающем порядке: в первую пробирку засевают 1 см культуры из бульона Китт-Тароцци, во вторую - 1 см из первой пробирки, в третью - 1 см из второй и так до пятой пробирки.

После тщательного перемешивания полученных разведений культуры из каждой пробирки среду насасывают в стеклянные трубки (длиной 20 см и диаметром 0,75 см), один конец которых закрыт ватой, а другой - оттянут. Среду насасывают на уровень не более длины трубки, после чего оттянутый конец трубки запаивают (при запайке, во избежание разбрызгивания материала, нельзя держать противоположный конец зажатым).

Трубки со средой быстро остужают под струей холодной воды и помещают в термостат с температурой 37 °С. На 2-5 сутки посевы в трубках просматривают и отмечают рост отдельных колоний. Обычно анаэробные бактерии растут в глубоких слоях агара (ниже 1 см от верхнего края). При наличии газа столбик агара разрывается. В местах нахождения отдельной колонии трубку надпиливают, фламбируют над пламенем и разламывают. Колонию снимают петлей вместе с агаром и переносят в пробирку со средой Китт-Тароцци.

В случае необходимости изучают культуральные и биохимические свойства выделенной чистой культуры.

Для биологической пробы используют исходный материал, а также культуру.

Заражение опытных животных производят тем же материалом, который используют для бактериологических посевов.

При подозрении на эмфизаматозный карбункул заражают внутримышечно морскую свинку взвесью в дозе 0,5-1 см, которая погибает через 16-96 ч; при подозрении на злокачественный отек также заражают внутримышечно морскую свинку или мышь взвесью в дозе 1 см, которая погибает через 12-24 ч после инъекции; при подозрении на брадзот овец заражают подкожно или внутримышечно морскую свинку, которая погибает через 1-2 суток; при подозрении на дизентерию ягнят и энтеротоксемию овец для внутримышечного заражения используют кроликов или морских свинок, которые погибают в течение первых суток; при подозрении на столбняк заражают фильтратом из культуры в дозе 0,5-0,8 см подкожно белых мышей в области корня хвоста, животные погибают на 3-4 сутки; при подозрении на некробактериоз заражение в дозе 0,5-1 см кроликов и белых мышей производят под кожу в области уха (кролик) или живота (мышь). На месте инъекции, особенно на ухе, появляются некрозы. Животные погибают через 5-10 суток, иногда они выживают.

Исследование на определение ботулизма (токсинообразование) проводят на белых мышах.

Нейтрализация токсина противоботулинической сывороткой

Используемый материал предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:2, выдерживают при комнатной температуре 1-1,5 ч для экстрагирования токсина, затем настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15-20 мин.

Нейтрализация токсина: к 0,5-0,8 см фильтрата добавляют 0,2 см смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типов , , , , и по 0,04 см каждого типа. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.

Двум мышам вводят по 0,5-0,8 см исследуемого фильтрата или центрифугата внутрибрюшинно или внутривенно (внутривенно вводят только центрифугат). Другим двум мышам вводят смесь фильтрата и сыворотки.

Аналогичное испытание может быть проведено с 6-7 суточной культурой, выращенной на печеночном бульоне.

В этом случае отсасывают пастеровской пипеткой верхний слой культуры, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и далее поступают, как и при испытании настоя.

Если мыши, получившие фильтрат, не обработанный противоботулинической сывороткой, погибают, результат биопробы положительный (в мясе имеется токсин). Мыши, которым вводилась смесь фильтрата с сывороткой (контрольные), выживают.

В случае гибели всех четырех мышей следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз.

При обнаружении в испытуемом материале ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.

Электронный текст документа

подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:

официальное издание

М.: ИПК Издательство стандартов, 1999